REVISTA CUBANA
DE TRANSFORMACIÓN DIGITAL
ARTÍCULO ORIGINAL
RNPS 2487 • ISSN 2708-3411
Vol. 4 • Nro. 3 • julio-septiembre 2023 • e217
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Captura y procesamiento de imágenes
para el diagnóstico molecular
de la Fibrosis Quística
Images Capture and Processing
for Molecular Diagnostics of Cystic Fibrosis
Lorena Díaz Mora
felorenacm@icb.cujae.edu.cu
Mirtha Irizar Mesa
mirtha@automatica.cujae.edu.cu
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA HABANA JOSÉ ANTONIO ECHEVERRÍA, CUJAE, CUBA
Recibido: 2023-04-02 • Aceptado: 2023-07-14
RESUMEN
La fibrosis quística es una enfermedad hereditaria presente en Cuba. Para
su diagnóstico confirmatorio se realiza la prueba del sudor como estándar
de oro, mientras que el análisis genético se utiliza en la detección prenatal
y preconcepcional de portadores, con el fin de identificar el riesgo de tener
un hijo con esa enfermedad. El Centro de Inmunoensayo (CIE), de Cuba, ha
desarrollado un lector de microarreglos de ADN, con la finalidad de mejorar
el pesquisaje neonatal de la enfermedad; sin embargo, carece de una aplica-
ción para realizar la validación de la calidad de las muestras con precisión.
Este trabajo presenta una herramienta computacional que permite obtener
las imágenes a partir de la puesta en marcha del lector y procesarlas, transcu-
rriendo por las tres etapas fundamentales en el procesamiento de imágenes
de microarreglos. Se validó mediante pruebas funcionales que garantizan su
correcto funcionamiento, permitiendo determinar las principales mutacio-
nes causantes de la fibrosis quística en cada una de las muestras estudiadas,
con alto grado de confiabilidad.
Palabras clave: fibrosis quística, microarreglos, procesamiento de imá-
genes.
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ABSTRACT
Cystic Fibrosis is a hereditary disease present in Cuba and for its confirma-
tory diagnosis the sweat test is performed as the gold standard, while genetic
analysis is used in the prenatal and preconceptional detection of carriers in
order to identify the risk of having a child with this disease. Taking this last
element into account, genetic analysis should be included in routine diagnosis.
e Immunoassay Center has developed a DNA microarray reader in order to
improve neonatal screening for the disease; however, it lacks an application to
accurately validate the quality of the samples. is work presents a computa-
tional tool that allows obtaining the images from the start-up of the reader and
processing them, going through the three fundamental stages in the processing
of microarray images. It was validated through functional tests that guarantee
its correct functioning, allowing to determine the main mutations that cause
Cystic Fibrosis in each of the samples studied, with a high degree of reliability.
Keywords: Cystic Fibrosis, image processing, microarrays.
INTRODUCCIÓN
El Centro de InmunoEnsayo (CIE) es una organización de vital importancia en el impulso de
las ciencias cubana e internacional, cuya tarea fundamental es facilitar la detección o evitar
de manera precoz enfermedades que pueden afectar la calidad de vida del ser humano. Por
esta razón, dedica sus esfuerzos a la creación y el perfeccionamiento de la Tecnología Suma
(Sistema Ultra Micro Analítico), la cual se ha especializado en el desarrollo de equipamiento,
sistemas de diagnóstico y estrategias para programas de salud.
Esta tecnología forma parte indispensable del Ministerio de Salud Pública de Cuba (MIN-
SAP) y ofrece la posibilidad de realizar estudios a escala masiva, cubriendo el ciento por cien-
to de los programas de pesquisa neonatal, certificación de sangre y vigilancia epidemiológica.
Entre los programas de pesquisa neonatal que se desarrollan en el centro, se encuentra un
proyecto encaminado al Diagnóstico Molecular de la Fibrosis Quística (FQ), enfermedad cau-
sada por la mutación de un gen llamado regulador de la conductancia transmembrana de la
FQ (CFTR, por sus siglas en inglés), que afecta al organismo de forma generalizada causando
muerte prematura. En Cuba, su incidencia es de alrededor de 1 cada 5 000 nacidos vivos, sien-
do considerada un problema de salud (Armas et al., 2019).
El diagnóstico se realiza mediante el examen clínico y la prueba de electrolitos en el su-
dor, la cual tiene problemas de especificidad y, por tanto, es necesario tener un ensayo que
defina exactamente el tipo de mutación. Para que el sistema de salud cubano disponga de
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este ensayo, se necesitan síntesis de oligonucleótidos, placas Greiner, un robot dispensador de
microarreglos y un lector de microarreglos para obtener las imágenes correspondientes a los
oligos dispensados.
El logro de todos estos elementos facilitaría la detección temprana de los niños que pre-
sentan la enfermedad, incidiendo en la disminución de su mortalidad y permitiría obtener
una tecnología propia del país, que nos dotaría de independencia y sería más económica, pues
en el mercado internacional un test (ADN) de FQ para una persona ronda los 900.00 USD.
En apoyo a este diagnóstico, desde 2007 hasta hoy se ha desarrollado un proyecto enca-
minado al diseño de un lector de microarreglos, MICROLEC. En una etapa inicial se logró
realizar una serie cero de este equipamiento y posteriormente un prototipo (Centro de Inmu-
noensayo, 2016). Ambos equipamientos, para principios del año 2020, aún presentaban defi-
ciencias estructurales y electrónicas en su diseño, lo cual se reflejaba en la calidad de la obten-
ción de las imágenes provenientes de los lectores. Esta situación, dificultaba la interpretación
biológica de esas imágenes.
Siendo así, se decidió por parte de un grupo multidisciplinario del centro, realizar un
nuevo diseño, MICROLEC II, que basado en las experiencias anteriores permitiera lograr fi-
nalmente un equipamiento capaz de propiciar imágenes relevantes para el diagnóstico de la
enfermedad y que además se pudiera exportar a los países de América Latina, donde el centro
tiene algunas sucursales.
Ante este nuevo equipamiento, era imperante la necesidad de desarrollar un software para
la captura y el procesamiento de estas imágenes, lo cual permitiera contar con una herramien-
ta que facilite el análisis automático de las imágenes capturadas por el lector en tiempo real.
METODOLOGÍA
Un microarreglo es comúnmente definido como una colección de gotas microscópicas orga-
nizadas en forma de cuadrícula o rejilla y adheridas a una superficie sólida o membrana. Un
ensayo de microarreglo para diagnóstico es una técnica que consiste en la adsorción de bio-
moléculas sobre un soporte sólido formando una matriz. Esas biomoléculas se incuban con
la muestra que se va a analizar, donde se produce el reconocimiento y la unión con los ácidos
nucleicos (Wu, E., A. Su, Billings, Brooks, & Wu, X., 2012). A continuación, la reacción es reve-
lada con el uso de marcadores fluorescentes, generalmente de cianina, Cy3 (rojo) y Cy5 (ver-
de), los cuales tienen emisiones en los rangos de 510-550 nm y 630-660 nm, respectivamente.
Posteriormente, se obtiene la imagen a través de un lector y las herramientas bioinformáticas
permiten interpretar y analizar los resultados (Bolón-Canedo & Alonso-Betanzos, 2019).
Teniendo como base las premisas anteriores, en una primera etapa de la investigación se
estudiaron e implementaron varios algoritmos para analizar una imagen de microarreglos
para diagnóstico, pasando por las tres etapas fundamentales de su análisis: preprocesamiento
y grillado, segmentación y extracción de características (Belean, Gutt, Costea, & Balacescu,
2020; Shao, D., Li, Zhang, Yang, & Shangguan, 2019).
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Durante los últimos años se han desarrollado software libres, como ScanAlyze, GenePix
y QuantArray. En estos se implementan métodos de segmentación como el de Watershed y
Crecimiento de Regiones, los cuales permiten reconocer y extraer la intensidad del gen. Tam-
bién son utilizados otros software, como Bioconductor, MeV, GEPAS; pero aún existen pro-
blemas para procesar imágenes de baja calidad o imágenes ruidosas y débiles. Por tanto, el
avance tecnológico exige obtener nuevas metodologías para alcanzar expresiones del gen de
calidad superior (Bello, Colombini, & Takeda, 2015).
Requerimientos de la aplicación
Para la implementación de cada una de las etapas por las que transitan las imágenes de mi-
croarreglos, se concibió, desde la etapa de diseño, una aplicación con las siguientes especifica-
ciones:
Requerimientos funcionales
• Inicialización de la lectura para capturar la imagen a través de una cámara CCD por co-
nexión USB a la PC.
• Preprocesar, segmentar y extraer características de las imágenes.
• Guardar todas las imágenes de microarreglos que son analizadas.
Requerimientos no funcionales. El software debe:
• Ser compatible con las versiones del sistema operativo Microsoft Windows.
• Indicarle al usuario el flujo de actividades hasta lograr los elementos que permitan el
diagnóstico molecular final.
• Poseer una interfaz amigable y de fácil interpretación.
Para la confección del programa se seleccionó la arquitectura de software del tipo «n ca-
pas». Esta arquitectura tiene como objetivo primordial la separación de la lógica de datos de
la presentación al usuario, aunque existe una comunicación entre ellas para el correcto fun-
cionamiento del software. La ventaja principal de este estilo es que el desarrollo se puede lle-
var a cabo en varios niveles y, en caso de que sobrevenga algún cambio, solo se ataca al nivel
requerido sin tener que revisar todo el código mezclado.
Descripción de la estrategia propuesta
La herramienta computacional (figura 1) se desarrolló en Microsoft Visual Studio. emplean-
do métodos presentes en la biblioteca de código abierto Emgu CV (versión 4.1). En la venta-
na principal del programa se muestran dos funciones básicas: Inicializar lectura y Procesar
imágenes (figura 1). En la primera función se realiza una inicialización del sistema a partir de
la configuración establecida y el correcto posicionamiento de los elementos del lector, como
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es el caso de los motores, los dispositivos ON/OFF y la placa Greiner. Además se capturan y
guardan las imágenes provenientes del lector (figura 2).
La etapa de procesar imágenes (figura 3) permite cargar la imagen y realizar cada una de
las etapas del procesamiento hasta la obtención de los valores necesarios para efectuar la in-
terpretación de los resultados.
Fig. 1
Ventana principal
de la aplicación.
Fig. 2
Diagrama
de flujo principal
del programa.
Fig. 3
Diagrama de flujo principal
del procesamiento
de las imágenes.
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Preprocesamiento y grillado
Una vez obtenida la imagen que se va a analizar, se transforman las intensidades de las seña-
les adquiridas en datos numéricos, discriminando la señal informativa del ruido que pudiera
haber en segundo plano. De esta manera, se obtiene una matriz de expresión donde las filas
serán genes y las columnas experimentos. En los diseños con dos fluoróforos se trabaja con
proporciones entre las intensidades medidas con cada uno de ellos. Además, los datos se nor-
malizan y transforman para disminuir las variaciones y hacer los cálculos posteriores más
sencillos (Belean et al., 2020; Farouk & SayedElahl, 2016).
Para lograr las condiciones anteriores se realiza un algoritmo inicial con la implemen-
tación de filtros y operaciones morfológicas que permiten normalizar los datos, reducir los
ruidos y enriquecer la calidad de la imagen. Posteriormente, se ejecuta el proceso de grillado,
el cual consiste en la asignación de coordenadas a cada uno de los puntos en la imagen para
identificar su localización.
Segmentación
En la etapa de segmentación se implementaron tres algoritmos y se deja a libre elección por
parte del usuario cuál es el óptimo según las necesidades presentes:
• Método de umbralización local y global combinados: el primer paso es ecualizar las dife-
rencias de iluminación entre los puntos con la implementación de una transformación lo-
garítmica. A continuación, se realiza la umbralización global sobre toda la imagen, la cual
permite separar intensidades en dos picos en la imagen. La umbralización local se realiza
sobre subimágenes y se determina un umbral para cada partición. Posteriormente, se com-
binan ambas imágenes, lo cual permite linealizar la intensidad de los puntos, obteniéndose
mejores resultados. Además, se rellenan los huecos en los puntos para evitar la unión de
unos con otros o mala detección de sus bordes (Gjerstad, Aakra, & Indahl, 2009).
• Agrupamiento por K- Medias: comienza con la inicialización de los centroides de los
clústeres, que serán solo dos: señal y fondo. Dado que el fondo de la imagen se caracteriza
por estar compuesto de píxeles con bajos valores de intensidad, se propone considerar el
píxel de mínimo valor de intensidad, como el representante del clúster que estará forma-
do por los píxeles que se clasificarán como pertenecientes al fondo. Por las mismas razo-
nes de representatividad, se propone usar el píxel de máximo valor de intensidad, como
representante del clúster que estará formado por los píxeles que clasificaremos como
pertenecientes a la señal. Otra razón por la que también es conveniente usar este criterio
en la aplicación, es debido a la metodología del dispensado en la placa de microarreglos
diagnósticos, ya que en los centros de cada punto estará siempre el píxel de mayor valor
de intensidad. Además, se necesita establecer una medida de similitud, para lo que se
propone usar la distancia Euclidiana, de manera tal que un píxel será agregado a un clús-
ter determinado si la distancia Euclidiana entre su valor de intensidad y la media de este
clúster es mínima (R.M. Farouk & SayedElahl, 2019; SivaLakshmi & Malleswara, 2018).
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• Fuzzy local information c means (FLICM): esta técnica es una versión modificada del
Fuzzy c means, la cual utiliza una medida de similaridad fuzzy local, con el objetivo de
garantizar la insensibilidad al ruido y la preservación de los detalles de la imagen. En
este sentido se adiciona un nuevo factor en la función objetivo, que incorpora un nivel
local de grises y una información espacial local, controlando la influencia de los píxeles
vecinos y dependiendo de la distancia de estos con el píxel central. En la aplicación
desarrollada, el valor de precisión escogido para el criterio de parada debe ser peque-
ño, para garantizar que realmente las funciones objetivo alcancen su valor mínimo,
por tanto se escoge 0.01. Para este último algoritmo, también se utilizan los valores de
máxima y mínima intensidad para inicializar las medias de los píxeles (Belean et al.,
2020; Kovalevsky, 2019).
Extracción de características
Para la etapa de extracción de características, la herramienta computacional permite obtener
la siguiente información numérica, que posteriormente será la base de la interpretación bioló-
gica de los resultados:
• Media de la señal y del fondo: media de las intensidades de los píxeles como valor para
asignar a cada punto del microarreglos y a los determinados como fondo.
• Mediana de la señal y del fondo: mediana de las intensidades de los píxeles que consti-
tuyen el gen de microarreglos y de las intensidades de los píxeles determinados como
fondo.
• Desviación estándar de la señal y del fondo: desviación estándar de las intensidades de
los píxeles que constituyen la señal y los que son fondo.
• Medidas de la forma del punto del microarreglo: cantidad de píxeles que lo conforman.
Índices de evaluación
Para realizar un análisis comparativo de los procesos de segmentación y sus resultados, se
implementan en esta etapa los siguientes índices de evaluación (R.M. Farouk & SayedElahl,
2019):
• Error cuadrático medio normalizado como medida cuantitativa
donde M y N son las dimensiones de la imagen,
son los píxeles originales y de los
clústeres respectivamente. Un valor cercano a cero de NMSE significa que la segmenta-
ción realizada presenta precisión, por lo cual es correcta (Bolón-Canedo & Alonso-Be-
tanzos, 2019; V.G. & P., 2014).
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•Exactitud:
•Sensibilidad:
•Especicidad:
donde TP es el número correcto de pixeles segmentados como señal en la imagen, TN es
el número correcto de pixeles segmentados como fondo, FP es el número de pixeles esco-
gidos falsamente como fondo y FN es el número de pixeles pertenecientes al fondo y re-
conocidos falsamente como señal en la imagen (Gjerstad et al., 2009; Shao D et al., 2019).
• Índices de Homogeneidad (I
H
): Calculado como la distancia promedio entre cada dato y
el centro del clúster, al que dicho dato ha sido agregado.
donde x
i
y C
j
(x
i
) son el elemento i y el centro del clúster C
j
, respectivamente. N es la
cantidad total de elementos y N
Ck
la cantidad de elementos que pertenecen al clúster
C
k
. D es la distancia euclidiana. IH representa cuán compacto es un clúster y está estre-
chamente relacionado con la varianza dentro del clúster. Un decrecimiento de I
H
suge-
rirá una mejora en el resultado del agrupamiento.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las imágenes provenientes del lector del CIE fueron procesadas inicialmente con el software
presente en el centro: MRS versión 1.0, diseñado con el objetivo de brindar una herramienta
para la interpretación de los resultados por parte de los analistas y los laboratorios donde se
implemente la tecnología. Este software fue desarrollado para la versión inicial del lector, im-
plementando las tres etapas básicas del procesamiento de imágenes y en el caso de la segmen-
tación los algoritmos que utiliza son: Corte, Canny y Crecimiento de Regiones por agregación
de píxeles (SRG).
A pesar de que MRS presenta algoritmos de segmentación distintos a los implementados,
se decidió analizar este grupo de imágenes en ambos software, ya que es de vital importancia
la eficiencia de estos en el tratamiento de este tipo de imágenes, las cuales según el experi-
mento que se realice permiten detectar diferentes tipos de mutaciones genéticas. En este caso,
queda en manos de los analistas determinar como usuarios de las aplicaciones, qué caminos
debe recorrer para obtener los resultados esperados según la necesidad biológica.
En el proceso de validación del software, se lograron medir índices de especificidad (sp),
sensibilidad (se) y exactitud (acc), para determinar cuáles algoritmos son más eficientes según
las características de la imagen (tabla 1). Se concluye que los métodos más eficientes son los
de K-Medias y FLICM, pues combinan rapidez computacional y proximidad de resultados a
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Fig. 4 a) Ejemplo de una imagen de buena calidad con alto contraste y poco ruido,
b) Imagen de pobre calidad con bajo contraste y mucho ruido y c) Imagen de calidad normal.
los esperados. Los valores de los índices son elevados en estos tres métodos lo que indica que
son algoritmos que presentan un buen desarrollo y la clasificación de los píxeles en la imagen
se realizó de forma correcta ya que los valores de se en los tres métodos superan el 90 %.
Según las características de las imágenes procesadas, todos los métodos muestran buenos
resultados en imágenes de calidad normal, mientras que el K-medias aporta los mejores re-
sultados en imágenes de buena calidad, alto contraste y poco ruido, y el FLICM presenta los
mejores resultados en imágenes de pobre calidad, bajo contraste y mucho ruido. Un ejemplo
de estos grupos de imágenes se muestra en la figura 4.
También se comprobó que los nuevos métodos de segmentación resuelven algunas des-
ventajas de los anteriores, como son:
• Dependencia del criterio de los expertos para establecer valores de corte y de las regiones
a segmentar. Estos elementos, en las primeras etapas del desarrollo, son bastante difíci-
les de definir con exactitud.
• Mayor tiempo de ejecución, como en el caso de la segmentación por SRG, lo cual cons-
pira con la necesidad de trabajo con grandes volúmenes de muestras en un laboratorio.
• Los algoritmos presentan un funcionamiento pobre si las regiones no tienen una inten-
sidad homogénea.
Evaluación del software
Para medir los parámetros que establece la norma ISO 9000: 2005 Ingeniería de Software,
se realizan pruebas funcionales de caja negra, se verifica el empleo de facilidades de uso del
lenguaje de programación utilizado, se inspecciona la operatividad de la interfaz de usuario
Tabla 1. Índices de evaluación cuantitativa de los métodos de segmentación implementados
Método K-Medias FLICM Umbralización Corte Canny SRG
sp 0,7839 0,8388 0,7036 0,6654 0,8521 0,7025
se 0,9825 0,9949 0,9051 0,7054 0,8844 0,7963
acc 0,8565 0,8898 0,8014 0,7065 0,8954 0,8245
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y se hacen pruebas con usuarios reales. Además, se ejecuta un chequeo de lista de elementos
contemplados durante el diseño y se verifica que se haya respetado la arquitectura de softwa-
re establecida, la cual permite la facilidad de uso y de mantenimiento de la aplicación, ya que
cualquier elemento que se necesite modificar o reparar no implica hacer cambios en el soft-
ware en su totalidad. Es importante destacar que esta aplicación cumple todos los requisitos,
teniendo en cuenta que fue desarrollada específicamente para el lector de microarreglos MI-
CROLEC II, por tanto su finalidad principal no es comercial, sino investigativa.
Interpretación biológica de los resultados
Finalmente se probó la aplicación en un grupo de imágenes de FQ. A partir de los valores de
intensidad, área del píxel en la imagen y la media de estos valores, los especialistas obtuvieron
el nivel de expresión de cada gen y el tipo de mutación presente. Se lograron identificar ocho
tipos de mutaciones del gen CFTR y los niveles de expresión de estas. Además, se pudo con-
cluir que de ellos 47 % presentan la mutación F508 y 50 % de los alelos afectados no se pudie-
ron determinar, pues no se corresponden a ninguna de las 33 mutaciones, con alta frecuencia
a nivel mundial detectadas. Culminados estos análisis, se realizó una evaluación cualitativa
por fluorescencia en las imágenes obtenidas, que permitió lograr resultados para el diagnósti-
co molecular de la FQ. De esta forma, se detectó cuando se está en presencia de un individuo
sano, un paciente heterocigótico compuesto (figura 5), el cual presenta dos mutaciones dife-
rentes, una en cada parental; y paciente homocigótico, el cual muestra la misma mutación en
los dos parentales y no se expresa este gen de forma normal.
CONCLUSIONES
En este trabajo se expone una aplicación como solución viable y propia para el tratamiento de
las imágenes de microarreglos de ADN. Su diseño e implementación era de vital importancia,
teniendo en cuenta que se procesan imágenes provenientes del lector diseñado en el centro,
por lo cual los análisis implementados responden a las necesidades de los estudios que se de-
sarrollan en el CIE.
Fig. 5 Ejemplo de un paciente portador a) Gen CFTR G85E, marcado con Cy5
y b) mutación G85E del gen CFTR marcado con Cy3.
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Este software logra diferenciar entre el alelo normal (marcado con Cy5) y el mutado (mar-
cado con Cy3), y detectar si los pacientes son no portadores, portadores heterocigóticos u ho-
mocigóticos. Su integración al lector desarrollado ha permitido dotar al Sistema Nacional de
Salud de un equipamiento completo que facilitará avanzar en el perfeccionamiento de la me-
dicina de precisión, posibilitando el diseño de tratamientos personalizados con fármacos di-
rigidos a grupos específicos de pacientes. Además, dadas las características de esta tecnología,
el empleo de este software ayudará a incrementar el rendimiento en el proceso de análisis y la
validación de los diferentes ensayos que se pudieran estudiar en esta plataforma tecnológica.
A pesar de haber logrado el objetivo principal, se recomienda seguir desarrollando y mejo-
rando el software del lector, con el objetivo de que crezca como herramienta de utilidad para
analizar imágenes tanto de microarreglos de ADN como de proteínas. También, perfeccionar
la etapa de segmentación en la aplicación ante la presencia de imágenes con alto ruido y poco
contraste, y valorar la posibilidad de implementar las funcionalidades del software en otros
lenguajes, como es Python y el uso de la librería de código abierto OpenCV.
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Inmunoensayo, en su área de Instrumentación, y en particular al M. Sc. Abel
Toledano Hernández, por incluirnos en el proyecto «Lector de Microarreglos para los Progra-
mas de Pesquisa Neonatal» y confiarnos una parte fundamental de este diseño.
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